LAPORAN RESMI
PRAKTIKUM
BIOANALISIS I
Uji
Batas Mikroba dalam Sediaan Obat Tradisional
KELAS / KELOMPOK : B/4
ANGGOTA KELOMPOK : 1. Erryza
Amadea (2011210085)
2. Faradilla Hanita Sari (2011210091)
3.
Febrina Nurmayadewi (2011210092)*
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PANCASILA
JAKARTA
2014
PENDAHULUAN
A. Latar
Belakang
Mikroba terdapat hampir disemua tempat.
Mulai dari permukaan tanah sampai pada lapisan atmosfer paling tinggi. Bahkan
pada obat-obatan tradisional yang kita konsumsi juga terdapat mikroorganisme.
Dalam proses pembuatan obat tradisional tidak
menutup kemungkinan terjadinya pencemaran oleh mikroba, sehingga perlu
dilakukan pengujian cemaran mikroba. Sampel
dilakukan uji cemaran mikroba, dalam hal ini bakteri
dan kapang/khamir dengan metode uji cemaran angka lempeng total dan angka
kapang/khamir total.
Metode kuantitatif digunakan untuk
mengetahui jumlah mikroba yang ada pada suatu sampel, umumnya dikenal dengan
Angka Lempeng Total (ALT). Uji Angka Lempeng Total (ALT) dan lebih tepatnya ALT
aerob mesofil atau anaerob mesofil menggunakan media padat dengan hasil akhir
berupa koloni yang dapat diamati secara visual berupa angka dalam koloni(cfu)
per ml/g atau koloni/100ml. Cara yang digunakan antara lain dengan cara tuang,
cara tetes dan cara sebar.
Prinsip pengujian Angka Lempeng Total menurut Metode
Analisis Mikrobiologi yaitu pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil setelah
cuplikan diinokulasikan pada media lempeng agar dengan cara tuang dan
diinkubasi pada suhu yang sesuai. Pada pengujan Angka Lempeng Total digunakan
PDF (Pepton Dilution Fluid) sebagai pengencer sampel dan menggunakan PCA (Plate
Count Agar) sebagai media padatnya
Metode
MPN biasanya biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam contoh
yang bebentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk contoh berbentuk padat.
MPN (Most Probable Number) adalah pemeriksaan angka
bakteri dengan perkiraan jumlah terdekat. Pemeriksaan MPN Coliform metode
tabung ganda didasarkan bahwa bakteri golongan coli dapat meragikan laktosa,
membentuk asam atau gas. Untuk itu digunakan metode ini :
a.
Uji Duga ((Presumtive Test)
Perbenihan
yang diperlukan adalah lactose broth. Uji ini bertujuan untuk mengetahui adanya
bakteri coliform dalam contoh air serta memperkirakan MPN (Most Probable
Number) dari jasad renik yang ada di dalam sampel air
b.
Uji Penegasan (Confirmatory
Test)
Pembenihan
yang dipakai adalah B.G.L.B. Adapun yang diperiksa adalah semua tabung yang
positif (keruh + gas) pada Lactose Broth. Pindahkan dengan jarum ose dari
tiap-tiap tabung yang positif ke B.G.L.B kemudian masukkan ke dalam
incubator 35-37oC selama 1 x 24 jam. Tabung yang menunjukkan keruh
dan gas dianggap positif. Uji Penegasan bertujuan untuk menunjukkan adanya
bakteri coliform dan bukan bakteri lain dalam sampel air.
c.
Uji Lengkap (Complete Test)
Tes ini ditunjukkan untuk menentukan
jenis dari coliform misalnya E. Coli, A.aerogenesis, E. freundii, dan lain-lain
dengan melihat hasil peragian kuman (test biokimia)
Dalam praktikum ini suatu
sampel obat tradisional dilakukan pengenceran (10-2,
10-3, 10-4), kemudian
masing-masing tabung dengan seri 3-3-3 dimasukkan 1 ml ke dalam tabung yang
berisi 9 mL TSB. Untuk setiap pengenceran digunakan 3 seri tabung. Setelah
diinkubasi selama 2 x 24 jam dengan suhu 37°C, maka akan dapat dilihat tabung yang positif yaitu tabung yang ditumbuhi
mikroba yang dapat ditandai dengan terbentuknya kekeruhan pada larutan dan
adanya koloni bakteri di permukaan larutan.
Uji
Angka Kapang Khamir (AKK) digunakan untuk menetapkan total kapang khamir dalam
tiap gram atau tiap ml sampel yang akan ditetapkan.
Setiap
sediaan mensyaratkan batas angka bakteri dan kapang/khamir tertentu yang masih
dianggap aman untuk dikonsumsi, yaitu < 104 koloni per ml untuk
kapang/khamir dan < 106 koloni per ml untuk bakteri. Hasil penghitungan angka lempeng total dan angka kapang / khamir
total dibandingkan dengan standar uji cemaran mikroba SNI 19-2897-1992.
Dengan demikian standar mikrobiologi
pada obat tradisional sangat diperlukan. Hal ini sangat erat hubungannya dengan
keamanan suatu produk yang dihasilkan serta menghindari terdeteksinyan bakteri
patogen pada kosmetik dan obat-obatan yang dapat menimbulkan suatu penyakit
bagi konsumen.
B.
Perumusan Masalah
1) Apakah bahan-bahan obat
tradisional yang beredar di pasaran memenuhi persyaratan uji mikrobiologi
sesuai peraturan yang berlaku di Indonesia atau tidak?
2) Apakah produk-produk
obat tradisional yang beredar di pasaran aman untuk dikonsumsi atau tidak?
C.
Tujuan dan Manfaat Percobaan
1.
Menghitung jumlah
dan menentukan jenis jasad renik aerob yang terdapat dalam sediaan obat
tradisional dalam tiap gram atau tiap ml sediaan.
2.
Memastikan
keamanan produk-produk obat tradisional yang beredar di pasaran untuk
kesehatan.
3.
Menguji
kelayakan penggunaan sediaan obat tradisional melalui perhitungan Angka Lempeng
Total (ALT), Angka Kapang Khamir (AKK), uji bakteri coliform MPN, uji Staphylococcus aureus koagulase positif,
uji Salmonella typhii, dan Uji Pseudomonas aeruginosa.
II. TINJAUAN
PUSTAKA
·
Teori Dasar
Pengukuran Pertumbuhan Bakteri
Pertumbuhan bakteri dapat diukur dengan beberapa
cara, yaitu dengan menghitung jumlah sel dan dengan mengukur massa total
populasi, yang biasanya sebanding dengan jumlah sel. Jumlah populasi biasanya
dihitung sebagai jumlah sel dalam 1 ml cairan atau 1 mg materi padat. Karena
populasi biasanya sangat besar, kebanyakan metode pengukuran didasarkan pada
pengukuran sampel yang sangat kecil, baik secara langsung maupun tidak
langsung. Ukuran populasi total kemudian ditentukan dengan perhitungan. Namun
demikian, cara ini kurang praktis sehingga dilakukan pengukuran secara tidak
langsung dalam suatu seri pengenceran. Dengan membuat seri pengenceran, kita
dapat memperkirakan jumlah bakteri dalam sampel.
Pertumbuhan bakteri dapat ditentukan dengan
beberapa cara penghitungan, antara lain dengan lempeng hitung, pengenceran
berseri, cara filtrasi atau penyaringan, metode penghitungan Nilai Duga
Terdekat, penghitungan langsung secara mikroskopik, atau dengan memperkirakan
jumalah bakteri dengan menggunakan metode tidak langsung.
· Lempeng Hitung
Cara penghitungan
ini sering digunakan untuk menghitung populasi bakteri. Keuntungan cara ini
adalah menghitung jumlah populasi yang mampu bertahan hidup. Kerugian cara ini
adalah membutuhkan waktu paling sedikit 24 jam atau lebih untuk membiakkan
koloni bakteri sehingga dapat diamati dan dihitung.
Dengan teknik
lempeng hitung, diasumsikan bahwa masing-masing bakteri yang hidup, tumbuh, dan
membelah membentuk satu koloni. Akan tetapi, hal ini tidak sepenuhnya benar
karena kadang-kadang sebuah koloni tidak berasal dari satu bakteri, tetapi dari
sebuah segmen rantai bakteri. Bila menggunakan lempeng hitung, penting
diperhatikan bahwa inokulum yang dibiakkan di atas lempeng agar harus dalam
jumlah yang terbatas supaya jumlah koloni yang dihasilkan sesudah inkubasi
dapat dihitung.
· Metode
Penghitungan Nilai Duga Terdekat
Metode lain untuk
mengetahui jumlah bakteri dalam sampel adalah penghitungan Nilai Duga Terdekat
(Most Probable Number, MPN). Teknik
perhitungan statistik ini didasarkan pada fakta bahwa semakin besar jumlah
bakteri dalam sampel, semakin besar pengenceran yang dibutuhkan untuk
mengurangi densitas sampai titik ketika tidak ada bakteri yang tumbuh dalam
tabung reaksi pada suatu seri pengenceran. Nilai Duga Terdekat merupakan angka
yang kemungkinan besar menunjukkan 95% jumlah populasi bakteri dan merupakan
angka yang paling mungkin untuk menyatakan jumlah populasi bakteri yang ada di
dalam sediaan, seperti yang tertera pada tabel terlampir.
Prinsip yang
digunakan dalam metode MPN :
MPN adalah suatu
metode enumerasi mikroorganisme yang menggunakan data dari hasil pertumbuhan
mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung yang ditanam dari
sampel padat atau cair yang ditanam berdasarkan jumlah sampel atau diencerkan
menurut tingkat seri tabungnya sehingga dihasilkan kisaran jumlah
mikroorganisme yang diuji dalam nilai MPN/satuan volume atau massa sampel.
Contoh :
Data yang didapat adalah : 3 tabung positif dari
pengenceran 1/10, 2 tabung positif dari pengenceran 1/100 dan 1 tabung positif
dari pengenceran 1/1000.
Lalu dicocokkan dengan tabel, menghasilkan nilai :
150 MPN/g.
Prinsip utama metode
ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu sehingga didapatkan
konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam dalam tabung
menghasilkaan frekuensi pertumbuhan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak
selalu”. Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah
pengenceran yang dilakukan) maka semakin “sering” tabung positif yang muncul.
Semakin kecil jumlah sampel yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang
dilakukan) maka semakin “jarang” tabung positif yang muncul.
MPN dinilai dari
perkiraan unit tumbuh (Growth Unit / GU) seperti CFU, bukan dari sel individu.
Meskipun begitu baik nilai CFU atau MPN dapat menggambarkan seberapa banyak sel
individu yang tersebar dalam sampel. Metode MPN dirancang dan lebih cocok untuk
diterapkan pada sampel yang memiliki konsentrasi <100/g atau ml. Oleh karena
itu nilai MPN dari sampel yang memiliki populasi mikroorganisme yang tinggi
umumnya tidak begitu menggambarkan jumlah mikroorganisme yang sebenarnya. Jika
jumlah kombinasi tabung positif tidak sesuai dengan tabel maka sampel harus
diuji ulang. Semakin banyak seri tabung maka semakin tinggi akurasinya tetapi
juga akan mempertinggi biaya analisa.
Pemilihan media
sangat berpengaruh terhadap metode MPN yang dilakukan. Umumnya media yang
digunakan mengandung bahan nutrisi khusus untuk pertumbuhan bakteri tertentu.
Jika terdapat ketidaksesuaian jenis media dan bakteri yang diinginkan maka
metode MPN akan menghitung bukan bakteri yang dituju. Untuk menghitung coliform
dapat menggunakan Lauryl Sulphate Tryptose (LST) broth, sedangkan untuk
menghitung E.coli diperlukan media EC (Escherichia coli) broth.
Jadi nilai MPN
adalah suatu angka yang menggambarkan hasil yang paling mungkin.
Menghitung angka MPN tanpa tabel
Nilai MPN ternyata dapat dicari dengan rumus
berikut (Thomas formula)
III. METODOLOGI PENELITIAN
A. Alat dan Bahan
-
Alat :
·
Tabung reaksi
steril
·
Pipet skala
steril
·
Lampu
spiritus
·
Erlenmeyer
·
Pinset
·
Rak tabung
·
Blue tip
·
Cawan petri
·
Kapas steril
-
Bahan :
· TSB (Tryptic
Soy Broth)
· LB (Lactose
Broth)
· Aquadest
· NA (Nutrient
Agar)
· Cetrimide Agar
· Mc. Conkey Agar
· VJA (Vogel
Jhonson Agar)
· TSIA & LIA
· Selenit & Tetrationat
· EMBA
· Sampel obat tradisional Beras Kencur
B.
Cara Kerja
Ø ALT dan
AKK
1)
Buka kemasan
sampel secara aseptik.
2)
Secara
aseptik, timbang 10 g atau pipet sebanyak 10 ml sampel dan masukkan segera ke
dalam labu erlenmeyer berisi 90 ml LDF steril. Dari proses ini diperoleh
suspensi/larutan sampel dengan konsentrasi 10-1.
3)
Lanjutkan
pengujian ke uji jumlah mikroba. Jika setelah homogenisasi larutan sampel
jernih, maka lakukan penentuan jumlah mikroba dengan teknik Angka Lempeng Total
(ALT) dan Angka Kapang Khamir (AKK). Jika setelah homogenisasi sampel berupa
suspensi/keruh, maka lakukan penentuan jumlah mikroba dengan teknik Angka
Paling Mungkin (APM)/Most Probable Number
(MPN).
4)
Dari hasil
persiapan dan homogenisasi sampel (konsentrasi 10-1), buatlah
beberapa seri pengenceran (misal: 10-2 s.d. 10-6). Dari
pengenceran 10-1, ambil 1 ml, masukkan ke dalam tabung berisi 9 ml
LDF steril, sehingga diperoleh pengenceran 10-2. Dari pengenceran 10-2
ambil 1 ml, masukkan ke tabung berisi 9 ml LDF steril, homogenkan, sehingga
didapat pengenceran 10-3. Dan seterusnya s.d. pengenceran 10-6.
5)
Untuk
penentuan ALT, 1 ml pengenceran 10-1 dituangkan ke dalam cawan petri
steril yang kosong, kemudian dituangi dengan NA cair bersuhu ±40-50oC
sebanyak 15-20 ml. Untuk penentuan AKK, media yang digunakan adalah PDA.
Goyang-goyang cawan untuk menghomogenkan, biarkan memadat di suhu ruang.
6)
Lakukan hal
yang sama untuk pengenceran 10-2 s.d. 10-6.
7)
Setelah semua
agar dalam cawan memadat, inkubasikan seluruh cawan dengan posisi terbalik, di
dalam inkubator pada suhu 37oC selama 24-48 jam (untuk bakteri) dan
suhu 20-25oC selama 3-5 hari untuk kapang khamir.
8)
Hitung ALT
dan AKK seperti pada materi menghitung mikroba dengan teknik angka lempeng
total.
Ø MPN
1)
Siapkan 14
tabung masing-masing berisi 9 ml media TSB.
2)
Bagi tabung
dalam 4 kelompok, kelompok pertama dan kedua masing-masing terdiri dari 4
tabung, kelompok ketiga dan keempat masing-masing terdiri dari 3 tabung.
3)
Pipet
masing-masing 1 ml larutan atau timbang masing-masing 1 gram zat yang diperiksa
ke dalam masing-masing tabung kelompok pertama sehingga diperoleh pengenceran
sampel 10-1 (0,1). Sisihkan 1 tabung.
4)
Pipet 1 ml
larutan dari tabung yang disisihkan ke dalam masing-masing tabung kelompok
kedua sehingga diperoleh konsentrasi sampel 0,01 (pengenceran 10-2).
Sisihkan 1 tabung.
5)
Pipet 1 ml
larutan dari tabung yang disisihkan ke dalam masing-masing tabung kelompok
ketiga sehingga diperoleh konsentrasi sampel 0,001 (pengenceran 10-3).
6)
Kelompok
keempat digunakan sebagai blangko.
7)
Inkubasikan
seluruh tabung pada inkubator bersuhu 35-37oC selama 24-48 jam.
8)
Amati adanya
pertumbuhan pada masing-masing tabung. Blangko idealnya tidak menunjukkan
pertumbuhan.
9)
Dengan
menggunakan tabel MPN dapat dihitung jumlah bilangan duga terdekat jasad renik
tiap gram atau tiap ml sediaan yang diperiksa.
Ø Uji
Jenis Mikroba
●
Analisis Cemaran Mikroba Patogen Escherichia coli
1)
Buka kemasan
sampel secara aseptik.
2)
Homogenisasi
sampel dan pengkayaan (enrichment).
Secara aseptik, timbang 10 g
sampel dan masukkan segera ke dalam labu erlenmeyer berisi 100 ml media Lactose Broth (LB) steril, kemudian
tutup rapat-rapat, kocok/gunakan orbital
shaker untuk menghomogenkan suspensi. Diamkan selama ± 1 jam di suhu kamar.
Inkubasi pada suhu 35oC selama ±24 jam.
3) Menanam ke media agar selektif.
Kocok/vortex suspensi dalam media LB yang
telah diinkubasi, kemudian dengan cara gores kuadran, inokulasikan 1 Ose
suspensi ke media agar Mc Conkey Agar
(MCA). Inkubasi pada suhu 35oC selama ±24-48 jam.
Jika
terdapat koloni spesifik pada media MCA dengan deskripsi seperti pada Tabel
5.1, inokulasikan koloni tersebut dengan teknik gores kuadran ke media agar
selektif Eosin Methylene Blue Agar
(EMBA). Inkubasi pada suhu 35oC selama 24-48 jam. Amati ada/tidaknya
pertumbuhan koloni spesifik seperti deskripsi yang tertera pada Tabel 5.1.
Pertumbuhan
spesifik Escherichia coli pada media
agar selektif ditandai dengan adanya koloni seperti dijelaskan pada tabel 5.1
berikut ini.
Tabel
5.1. Ciri khas morfologi Escherichia coli
pada media agar selektif.
|
Media
|
Deskripsi koloni
|
|
Mc Conkey Agar (MCA)
|
Merah bata, dapat dikelilingi daerah yang terdiri dari endapan empedu.
|
|
Eosin Methylene Blue Agar (EMBA)
|
Kilap logam
|
4) Uji lanjutan terhadap koloni yang diduga Escherichia coli.
Jika
terdapat koloni spesifik dengan warna kilap logam pada media EMBA, lakukan uji
lanjutan terhadap koloni tersebut. Inokulasikan koloni ke dalam tabung berisi
media LB steril dengan tabung Durham terbalik dan ke dalam media agar miring NA,
inkubasi pada suhu 35oC selama 24-48 jam. Dari hasil inkubasi,
lakukan pewarnaan gram dan uji IMViC.
Tabel
5.2. Hasil uji lanjutan untuk Escherichia
coli.
|
Pada media LB dengan
tabung Durham
|
Terdapat pertumbuhan
dan terbentuk gas di dalam tabung Durham
|
|
Hasil pewarnaan gram
|
Basil pendek, gram
negatif
|
|
Hasil uji IMViC
|
Indol (+), MR (+), VP
(-), SC (-)
|
· Analisis
Cemaran Mikroba Patogen Salmonella sp.
1) Buka kemasan sampel secara aseptik.
2) Homogenisasi sampel dan pengkayaan (enrichment).
Secara aseptik, timbang 10
g sampel dan masukkan segera ke dalam labu erlenmeyer berisi 100 ml media Lactose Broth (LB) steril, kemudian
tutup rapat-rapat, kocok/gunakan orbital
shaker untuk menghomogenkan suspensi. Diamkan selama ± 1 jam di suhu kamar.
Inkubasi pada suhu 35oC selama ±24 jam.
3) Pengkayaan selektif.
Kocok suspensi sampel yang
telah diinkubasi. Secara aseptik, pindahkan 1 ml suspensi ke dalam tabung
reaksi besisi 10 ml media Selenite
Cystine Broth dan 1 ml suspensi ke dalam 10 ml media Tetrathionate Broth. Inkubasi pada suhu 35oC selama ±24 jam.
4) Menanam ke media agar selektif.
Kocok/vortex suspensi dalam media Selenite dan Tetrationate yang telha
diinkubasi, kemudian dengan cara gores, inokulasikan masing-masing 1 Ose
suspensi ke media agar Brilliant Green
Agar (BGA). Inkubasi pada suhu 35oC selama ±24-48 jam. Selain
BGA, dapat pula digunakan media XLDA dan BSA sebagai media agar selektif.
Pertumbuhan spesifik Salmonella sp. pada media agar selektif
ditandai dengan adanya koloni seperti dijelaskan pada Tabel 5.3 berikut ini.
Tabel 5.3. Ciri khas morfologi Salmonella sp. pada media agar selektif.
|
Media
|
Deskripsi Koloni
|
|
Brilliant Green Agar
(BGA)
|
Kecil, transparan,
tidak berwarna atau merah muda hingga putih buram (sering dikelilingi zona
berwarna merah muda hingga merah)
|
|
Xylosa-Lysine-Desoxycholate
Agar (XLDA)
|
Merah dengan atau tanpa
pusat berwarna hitam
|
|
Bismuth Sulfite Agar
(BSA)
|
Coklat, abu-abu atau
hitam kadang disertai dengan kilap metalik. Media sekitar mulanya berwarna
coklat, seiring dengan waktu inkubasi berubah menjadi hitam
|
5) Uji lanjutan terhadap koloni yang diduga Salmonella sp.
Dengan
menggunakan jarum Ose, ambil koloni yang diduga Salmonella sp. dari media agar selektif, inokulasikan dengan cara
gores dan tusuk pada media agar miring TSIA. Lakukan yang sama ke media agar
miring LIA. Inkubasi selama 24-48 jam pada suhu 35oC.
Tabel 5.4. Hasil reaksi yang umum untuk Salmonella sp. pada media TSIA dan LIA.
|
|
TSIA
|
LIA
|
|
Lereng (slant)
|
Basa (merah)
|
Basa (ungu)
|
|
Tusukan/dasar (butt)
|
Asam (kuning)
|
Basa (ungu)
|
|
Produksi H2S (endapan hitam di daerah tusukan)
|
+ atau -
|
+
|
· Analisis
Cemaran Mikroba Patogen Staphylococcus
aureus.
1) Buka kemasan sampel secara aseptik.
2) Homogenisasi sampel dan pengkayaan (enrichment).
Secara aseptik, timbang 10
g sampel dan masukkan segera ke dalam labu erlenmeyer berisi 100 ml media Tryptic Soy Broth (TSB) steril, kemudian
tutup rapat-rapat, kocok/gunakan orbital
shaker untuk menghomogenkan suspensi. Diamkan selama ± 1 jam di suhu kamar.
Inkubasi pada suhu 35oC selama ±24 jam.
3) Menanam ke media agar selektif.
Kocok/vortex suspensi dalam media TSB yang diinkubasi, kemudian dengan
cara gores kuadran, inokulasikan masing-masing 1 Ose suspensi ke media agar Vogel Johnson Agar (VJA). Inkubasi pada
suhu 35oC selama ±24-48 jam. Selain BGA, dapat pula digunakan media
MSA dan BPA sebagai media selektif.
Pertumbuhan spesifik Staphylococcus aureus pada media agar
selektif ditandai dengan adanya koloni seperti dijelaskan pada Tabel 5.5
berikut ini.
Tabel 5.5. Ciri khas morfologi Staphylococcus aureus pada media agar
selektif.
|
Media
|
Deskripsi koloni
|
|
Vogel Johnson Agar
(VJA)
|
Hitam dikelilingi zona
kuning
|
|
Mannitol Salt Agar
(MSA)
|
Kuning dengan zona
kuning
|
|
Baird Parker Agar (BPA)
|
Hitam, berkilau,
dikelilingi zona jernih (2-5 mm)
|
4) Uji lanjutan terhadap koloni yang diduga Staphylococcus aureus (uji koagulase).
Jika terdapat koloni
spesifik pada media VJA dengan deskripsi seperti pada Tabel 5.5, lakukan uji
lanjutan terhadap koloni tersebut, yaitu uji koagulase. Ambil koloni tersangka
dan pindahkan ke dalam tabung yang berisi 0,5 ml plasma kelinci atau kuda.
Inkubasi dalam penangas air bersuhu 37oC, dan amati pada jam ke-3, 6
dst. sampai 24 jam. Lakukan uji bersamaan dengan kontrol positif dan negatif.
Jika terjadi koagulasi, maka sampel diduga mengandung Staphylococcus aureus.
· Analisis
Cemaran Mikroba Patogen Pseudomonas
aeruginosa.
1) Buka kemasan sampel secara aseptik.
2) Homogenisasi sampel dan pengkayaan (enrichment).
Secara
aseptik, timbang 10 g sampel dan masukkan segera ke dalam labu erlenmeyer
berisi 100 ml media Tryptic Soy Broth
(TSB) steril, kemudian tutup rapat-rapat, kocok/gunakan orbital shaker untuk menghomogenkan suspensi. Diamkan selama ± 1
jam di suhu kamar. Inkubasi pada suhu 35oC selama ±24 jam.
3) Menanam ke media agar selektif.
Kocok/vortex suspensi dalam media TSB yang diinkubasi,
kemudian dengan cara gores kuadran, inokulasikan masing-masing 1 Ose suspensi
ke media agar Cetrimide Agar (Cet.A).
Inkubasi pada suhu 35oC selama ±24-48 jam. Selain Cet.A, dapat pula
digunakan media Pseudomonas aeruginosa
sebagai media selektif.
Pertumbuhan
spesifik Pseudomonas aeruginosa pada
media agar selektif ditandai dengan adanya koloni seperti dijelaskan pada Tabel
5.6 berikut ini.
Tabel 5.6. Ciri khas morfologi Pseudomonas aeruginosa pada media agar
selektif.
|
Media
|
Deskripsi koloni
|
|
Cetrimide Agar (Cet.A)
|
Hijau berfluorosensi
|
|
Pseudomonas Agar untuk
deteksi fluoresin
|
Tidak berwarna hingga
kekuningan dengan fluoresensi kuning
|
|
Pseudomonas Agar untuk
deteksi piosianin
|
Kehijauan dengan
fluoresensi biru
|
4) Uji lanjutan terhadap koloni yang diduga Pseudomonas aeruginosa (uji koagulase).
Jika
terdapat koloni spesifik pada media Cet.A dengan deskripsi seperti pada Tabel
5.6, lakukan uji lanjutan terhadap koloni tersebut, yaitu uji oksidase.
Letakkan di atas koloni tersebut atau pindahkan koloni ke kertas saring yang
telah diimpregnasi (dijenuhkan) dengan N.N-dimetil-p-fenilendiamina-dihidroklorida.
Jika terjadi perubahan warna dari merah muda menjadi lembayung, maka sampel
diduga mengandung cemaran Pseudomonas
aeruginosa.
IV. HASIL
DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
Tabel
Pengamatan
|
Pengenceran AKK
|
Hari ke-1
|
Hari ke-2
|
Hari ke-3
|
Jumlah Jasad Renik Total
|
|||
|
10 -1
|
37
|
54
|
TNTC
|
92
|
TNTC
|
TNTC
|
12350 cFu/ml
|
|
10 -2
|
30
|
14
|
105
|
81
|
129
|
118
|
|
|
10 -3
|
TNTC
|
TNTC
|
TNTC
|
TNTC
|
TNTC
|
TNTC
|
|
|
Perhitungan AKK:
118 +
129 = 123,5 x 102 = 12350
cFu/ml
|
|||||||
|
Pengenceran
ALT
|
Hari
ke-1
|
Jumlah
Jasad Renik Total
|
|
|
10 -1
|
TNTC
|
TNTC
|
Tidak dapat dihitung
|
|
10 -2
|
TNTC
|
TNTC
|
|
|
10 -3
|
TNTC
|
TNTC
|
|
|
Pengenceran
MPN
|
Tabung
|
Jumlah
Jasad Renik
|
Total
Jasad Renik
|
||
|
1
|
2
|
3
|
|||
|
10-1
|
+
|
+
|
+
|
3
|
>1100 cfu/ml
|
|
10-2
|
+
|
+
|
+
|
3
|
|
|
10-3
|
+
|
+
|
+
|
3
|
|
|
Media
|
Hari
ke-1
|
Hari
ke-2
|
|
|
( + )
Ada pertumbuhan bakteri, media berwarna kuning
keruh. Dilanjutkan ke media MCA, Selenit Broth, dan Tetrationat Broth
|
( + )
Ada pertumbuhan bakteri, media (Selenit dan
Tetrationat Broth) berwarna putih keruh. Dilanjutkan ke media BGA
|
|
|
( + )
Ada pertumbuhan bakteri, media berwarna kuning
keruh. Dilanjutkan ke media VJA dan Cet.A
|
( - )
Pada media VJA tidak terdapat warna hitam
dikelilingi kuning pada bekas goresan, dan pada media Cet.A tidak terbentuk
hijau berfluorosence pada bekas goresan.
|
|
Media
|
Hasil
Pengamatan
|
Kesimpulan
|
|
||
|
-
VJA
|
(-) tidak terbentuk warna hitam dikelilingi
warna kuning
|
Tidak mengandung bakteri Staphylococcus aureus
|
|
-
Cetrimide
|
(-) tidak terbentuk hijau fluoresensi
|
Tidak mengandung bakteri Pseudomonas aeruginosa
|
|
||
|
-
Mc. Conkey
|
(-) Tidak terbentuk warna merah bata
|
Tidak mengandung bakteri Escherichia coli
|
|
-
Selenit
|
(+) putih keruh
|
Dilanjutkan ke media BGA
|
|
-
Tetrationat
|
(+) putih keruh
|
|
|
-
BGA
|
(+) terbentuk pink transparan di sekitar goresan
Selenit dan Tetrationat
|
Dilanjutkan ke media TSIA dan LIA
|
|
TSIA
|
LIA
|
||||||||||
|
Lereng
|
Tusukan
|
Lereng
|
Tusukan
|
||||||||
|
Asam
|
Basa
|
Asam
|
Basa
|
Gas
|
H2S
|
Asam
|
Basa
|
Asam
|
Basa
|
Gas
|
H2S
|
|
+
|
-
|
-
|
+
|
-
|
+
|
-
|
+
|
-
|
+
|
-
|
+
|
B.
Pembahasan
1. Pada Uji Jenis dengan menggunakan media TSB dan
LB, setelah sampel di inkubasi selama 24 jam pada suhu 35-37˚C terbentuk
kekeruhan dari warna sebelumnya, hal ini menandakan adanya cemaran mikroba,
sehingga sampel perlu di uji lanjut dengan perhitungan Angka Lempeng Total (ALT),
Angka Kapang Khamir (AKK), uji bakteri coliform MPN, uji Staphylococcus aureus koagulase positif, uji Salmonella typhii, dan Uji Pseudomonas
aeruginosa.
2. Pada perhitungan AKK didapat hasil pengamatan pada
ketiga seri pengenceran larutan hari ke -1 dan hari ke-2 sebagian besar didapat
jumlah koloni kapang khamir yang tidak terhingga (TNTC), dari hasil perhitungan
akhir didapatkan total bakteri 12350 cFu/ml ( >1100 cfu/ ml), hal ini
menunjukkan bahwa sampel jamu yang diuji tidak memenuhi syarat steril berdasarkan
British Pharmacopoeia Volume IV Tahun 2005, dimana sediaan pemberian secara
oral yang mengandung bahan alam adalah tidak ≥ 102 cfu/ml. Pencemaran ini mungkin dapat
disebabkan karena penanganan bahan baku dan proses pembuatan jamu yang tidak
higienisdan juga diakibatkan oleh adanya kontaminasi mikroba udara pada saat
pengemasan atau penjualan yang sangat mem-pengaruhi besarnya jumlah kontaminan
mikroba pada produk jamu.
3. Pengujian batas mikroba juga dilakukan dengan cara
perhitungan angka lempeng total (ALT), dan didapat dari hasil yang tidak dapat
dihitung (Too much to count) dimana
jumlah bakteri diperkirakan > 1100 cfu/ml, sehingga sampel ini tidak
memenuhi syarat steril berdasarkan British Pharmacopoeia Volume IV Tahun 2005,
dimana sediaan pemberian secara oral yang mengandung bahan alam adalah tidak boleh mengandung bakteri ≥ 104 cfu/ml.
4. Metode MPN dapat digunakan untuk menghitung jumlah jasad renik
tertentu yang terdapat diantara campuran jasad renik lainnya. Sebagai contoh,
jika digunakan media Larutan Dapar Fosfat (LDF), maka adanya bakteri yang dapat memfermentasi laktosa ditunjukkan
dengan terbentuknya kekeruhan pada
larutan dalam tabung. Cara ini biasa digunakan untuk
menentukan MPN koliform karena bakteri Coliform termasuk bakteri yang dapat
menfermentasi laktosa.
Didapat hasil yang positif
(+) pada semua seri pengenceran 10-1 sampai 10-3 , dengan
jumlah bakteri >1100 cfu/ml, sehingga sampel ini tidak memenuhi syarat
steril berdasarkan British Pharmacopoeia Volume IV Tahun 2005, dimana sediaan
pemberian secara oral yang mengandung bahan alam adalah tidak boleh mengandung bakteri ≥ 104 cfu/ml.
5. Pada Uji Bakteri Salmonella typhii dengan menggunakan media Selenit Broth didapat
hasil positif dimana media menjadi berwarna putih keruh dan media tetrationat
juga menjadi warna putih keruh, hal ini menunjukkan bahwa terdapat pertumbuhan
bakteri Salmonella typhii, sehingga
dilakukan uji lebih lanjut ke media BGA. Pada uji BGA juga didapat hasil yang
positif (+) dimana hasil goresan pada pada media tersebut memberikan warna putih
dikelilingi pink transparan yang mengartikan bahwa sampel positif (+) terdapat Salmonella typhii. Uji kemudian
dilanjutkan ke media TSIA dan LIA dengan
cara gores maupun tusuk, dan kedua media ini hasil positif (+) adanya
pertumbuhan Salmonella typhii yaitu
pada media TSIA terbentuk warna kuning (bersifat asam) pada daerah penggoresan
tabung dan di daerah tusukan terbentuk warna merah (bersifat basa). Selain itu,
pada media LIA juga memberikan hasil positif yaitu terbentuk warna ungu
(bersifat basa) di daerah goresan dan tusukan. Berdasarkan hal tersebut, maka
sampel yang diuji tidak memenuhi syarat British Pharmacopoeia Volume IV Tahun
2005, yang seharusnya sediaan pemberian secara oral yang mengandung bahan alam
tidak boleh mengandung bakteri Salmonella
typhii . Pencemaran ini dapat disebabkan karena Salmonella typhii dapat
mencemari sampel jamu secara langsung atau tidak langsung melalui air yang
tercemari oleh kotoran dari bahan mentah ataupun dari peralatan yang dipakai.
6. Pada uji bakteri Escherichia coli dengan menggunakan media Mc. Conkey Agar didapat
hasil yang negatif (-) dimana tidak terbentuk warna merah bata, sehingga dapat
dikatakan sampel yang diuji tidak mengandung bakteri Escherichia coli yang
merupakan kuman oportunis yang banyak ditemukan dalam usus besar mansuia
sebagai flora normal yangd dapat menjadi patogen ketika berada di jaringan luar
intestinal normal, maka uji tidak dianjutkan ke media EMBA.
7. Pada Uji bakteri Pseudomonas aeruginosa , didapat hasil yang negatif (-) dimana pada
media Cetrimide Agar tidak terbentuk warna hijau fluresensi di daerah goresan,
yang menunjukkan bahwa sampel tidak terdapat bakteri Pseudomonas aeruginosa.
8. Pada Uji bakteri Staphylococcus aureus dengan menggunakan media VJA, didapat hasil
yang negatif (-) dimana tidak terdapat warna hitam dikelilingi warna kuning
pada media akibat adanya produksi koagulase, dan proses fermentasi glukosa dan
manitol dengan memproduksi asam dalam keadaan anaerobik. Koagulase ini adalah
enzim yang dapat menggumpalkan plasma.
V. PENUTUP
A. Kesimpulan
1. Pada uji batas jasad renik sampel yang diuji
dengan menggunakan metode AKK, ALT, dan MPN didapat jumlah total jasad renik
adalah > 1100 cfu/ml.
2. Sampel yang diuji positif (+) mengandung bakteri Salmonella typhii, maka sampel tidak
layak untuk dikonsumsi.
B.
Saran
1.
Metode perhitungan bakteri sebaiknya dengan
menggunakan MPN karena pada ALT terdapat beberapa kelemahan seperti:
-
Kemungkinan terjadinya koloni yang berasal lebih dari
satu sel mikroba, sehingga dapat memperkecil jumlah sel mikroba yang
sebenarnya. Kemungkinan adanya jenis mikroba yang tidak dapat tumbuh karena
penggunaan jenis media agar, suhu, pH, atau kandungan oksigen selama masa
inkubasi.
-
Kemungkinan
ada jenis mikroba tertentu yang tumbuh menyebar di seluruh permukaan media agar
sehingga menghalangi mikroba lain. Hal ini akan mengakibatkan mikroba lain
tersebut tidak terhitung.
-
Penghitungan dilakukan
pada media agar yang jumlah populasi mikrobanya antara 30 – 300 koloni. Bila
jumlah populasi kurang dari 30 koloni akan menghasilkan penghitungan yang
kurang teliti secara statistik, namun bila lebih dari 300 koloni akan
menghasilkan hal yang sama karena terjadi persaingan diantara koloni.
VI.
DAFTAR PUSTAKA
The United States Pharmacopeial Convention, 2009. The
United States Pharmacopeia 32, Board
of Trustees.
Medicines Commission, 2005. British
Pharmacopoeia IV, Council of Europe.
Radji, DR. Maksum, M.Biomed.Buku Ajar Mikrobiologi
(Panduan Mahasiswa Farmasi dan Kedokteran).Jakarta:Penerbit Buku Kedokteran
EGC,2011.
Pratiwi, Sylvia T.Mikrobiologi Farmasi.Jakarta:Erlangga,2009.
No comments:
Post a Comment